Dalībnieks:Liiimlente/Smilšu kaste

LĀZERPLŪSMAS CITOMETRIJA

Nr.1 A) Punktu laukums; B) Blīvuma laukums; C) Kontūras laukums

Attēls Nr.2. Plūsmas citometra uzbūves pamatbloki

Lāzerplūsmas citometrija ir metode pamatā ir instrumentu sistēma, kas rada, apstrādātā un prezentē vienu vai vairākus mērījumus, kas veikti individuālām šūnām, kuras iegūtas no šūnu suspensijas. Šūnas parasti tiek krāsotas ar vienu vai vairākām fluorescentām krāsām, kas ir specifiskas interesējošiem šūnu komponentiem, piemēram, DNS, un katras šūnas fluorescence tiek mērīta, kamēr tās ātri šķērso uzbudinošo staru (lāzeru vai dzīvsudraba loka lampu). Fluorescence nodrošina kvantitatīvus mērījumus dažādām bioķīmiskām un biofizikālām šūnu īpašībām kā arī ir pamats šūnu šķirošanai.

Lāzerplūsmas citometrs sastāv no plūsmas kambara, lāzera, gaismas detektora, filtriem, krāsu detektoriem un datora . Plūsmas kambaris ir novietots instrumenta centrā. Tā sienas visbiežāk ir veidotas no kvarca. Tas ir radīts, lai piegādātu šūnas pa vienai vienā mērījumu punktā. Paraugs ir injicēts šķidruma (ūdens vai bufera) plūsmas centrā, kas saukta par apvalka šķīdumu. Ja plūsma ir lineāra, apvalka šķīduma un parauga plūsma nesajaucas un plūsmas diametrs ir sašaurināts, visbiežāk līdz 10 μm, nodrošinot šūnu virzību cauri plūsmas kambara centram.

Šūnas plūst cauri plūsmas kambarim pa viena ar ātrumu 500 šūnas sekundē. Gaismas avots var būt lāzers, loka lampa vai pat LED diode. Mūsdienās lielākajai daļai instrumentu tiek pielietoti lāzeri. Lāzeri ir pirmā izvēle, jo tie producē augstas intensitātes, monohromatiskas gaismas staru. Tiem ir arī mazs „punkta” izmērs, kas ir spējīgs gaismu fokusēt mazā diametrā. Tas ir nepieciešams, lai sasniegtu vienas šūnas maksimālo uzbudinājumu un samazinātu iespējamību vairākām šūnām šķērsot lāzera staru vienlaikus.

Ir pieejamas plašas gaisa dzesējamo un cietvielu lāzeru variācijas. Visplašāk izmantotais ir gaisa dzesējamais argona jonu lāzers, kurš producē 488 nm zilo gaismu. Šis viļņa garums ir piemērots fluorescento krāsu uzbudināšanai. Citi gaisa dzesējamie lāzeri, kas tiek pamatā lietoti, ir He-Ne (633 nm) un He-CD (325 nm) lāzeri. Kad šūnas virzās caur lāzeru, fluorohromi, kas piestiprināti šūnām, absorbē gaismu un emitē specifisku gaismas staru atkarībā no fluorohroma tipa. Filtri novirza fluorohromu gaismu uz krāsu detektoriem. Krāsu detektori uztver dažādās fluorohromu emitētās krāsas.

Lauztā gaisma un dažādu viļņa garumu fluorescence pēc tam tiek reģistrēta. Parasti gaisma tiek lauzta divos dažādos leņķos un līdz pat sešām vai vairāk fluorescencēm var tikt izmērītas. Lai arī parasti tiek analizētas šūnas (dzīvnieku, augu, aļģu, rauga, baktēriju), daļiņas kā kodoli, hromosomas, vai citas arī var tikt pētītas.

Gaismas detektors apstrādā gaismas signālus un sūta informāciju uz datoru. Šaurie lauztās gaismas leņķi sniedz informāciju par šūnas lielumu, savukārt platie leņķi sniedz informāciju par granulām, kuras satur šūnas. Katram imūnās sistēmas šūnu tipam ir unikāla šauro un plato lauzto gaismas leņķu mērījumu kombinācija, kas ļauj noteikt šūnu tipu un skaitu.

Dati parasti tiek izklāstīti vai nu viena parametra histogrammās , vai arī divu parametru kolaterāles laukos, bieži sauktos par citogrammām. Citogramma var būt izrādīta kā punktu laukums, blīvuma vai kontūras laukumā. (attēls Nr.1) Punktu laukumā katra reģistrētā šūna ir atzīmēta ar punktu.

Šīs tehnikas vērtīgums atspoguļojas tās spējā veikt mērījumus lieliem daudzumiem šūnu īsā laika periodā (sekunžu desmiti līdz minūtes). Var tikt atklāta heterogenitāte populācijās un dažādi šūnu subtipi var tikt identificēti un saskaitīti. Izvēlētās populācijas arī var tikt sašķirotas tālākiem pētījumiem. Lielākais plūsmas citometrijas trūkums ir tas, ka tai nepieciešam individuālu šūnu vai citu daļiņu suspensija ar minimālu daudzumu „atkritumu”. Tas nozīmē, ka audu arhitektūra un jebkāda informācija par dažādu šūnu savstarpēju ietekmi tiek zaudēta, kad šūnas vai daļiņas tiek sagatavotas.

Attēli

Attēls:https://lv.wikipedia.org/wiki/Att%C4%93ls:Histogrammas.png A) Punktu laukums; B) Blīvuma laukums; C) Kontūras laukums Attēls:https://https://lv.wikipedia.org/wiki/Att%C4%93ls:Citometra.uzbuves.bloki.png Plūsmas citometra uzbūves pamatbloki

Atsauces

• http://www.nlm.nih.gov/cgi/mesh/2011/MB_cgi?mode=&index=5211&view=concept
• http://flowbook.denovosoftware.com/Flow_Book/Chapter_1%3a_Introduction
• http://www.unsolvedmysteries.oregonstate.edu/flow_06